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    免疫熒光實驗的要領(lǐng)你可記清楚了？

    發(fā)布時間： 2023-06-28　　點擊次數(shù)： 939次
    　　免疫熒光實驗是一種廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的實驗技術(shù)，它通過利用熒光標記的抗體來檢測樣本中特定蛋白質(zhì)的存在和表達情況。原理基于抗體-抗原相互作用的特性。在該實驗中，首先需要將待檢測樣品中含有的目標分子（如蛋白質(zhì)）與對應(yīng)的抗體進行結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。然后，使用熒光標記的次級抗體與該復(fù)合物結(jié)合，從而標記出目標分子的存在位置和數(shù)量。
    　　免疫熒光實驗的技巧：
    　　1、細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次;對懸浮生長細胞，取對數(shù)生長細胞，用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
    　　2、固定。根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5min.
    　　3、通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5min.
    　　4、封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
    　　5、一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
    　　6、二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
    　　7、封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。